La regeneración de plantas sanas partiendo del cultivo in
vitro de ápices meristemáticos de ciertos
vegetales leñosos exige la búsqueda de técnicas complejas y su empleo acertado.
Esas técnicas deben permitir al explante
sortear frecuentes dificultades como la oxidación, la heterogeneidad de respuestas, la reversión al
estado juvenil, la presencia de inhibidores de
enraizamiento y, sobre todo, la sobre vivencia al trasplante en condiciones
autótrofas. El éxito obtenido en la regeneración de plantas libres de virus
partiendo de los trabajos de Morel et
al. (1952), que en la actualidad han producido comercialmente un centenar de
especies herbáceas, no tía sido posible
más que en contadas especies de frutales y forestales. Entre las especies rebel- des, más recientemente llamadas
‘recalcitrantes’, están el duraznero (Prii- une persica (L.) Batsch) y numerosos cítricos. Buscando una
mejor respuesta del ápice meristemático de algunos cítri- cos, Murashige et al.
(1972) y Navarro et al. (1975)
plantearon la posibili- dad del microinjerto in vitro de ápices sobre plántulas provenientes de semillas, logrando
así el desarrollo de plantas libres de numerosos virus (Navarro y 5 uárez, 1977; Roistacher, 1977). El
microinjerto in vitro fue aplicado más tarde al manzano (Alskief y Villemur,
1978), al damasco (Martínez et al.,
1979) y a las vides (Engel- brccht y Schwerdtfeger, 1979) en las que se Obtuvieron ejemplares libres de virus. Introduciendo
algunas modificaciones a las técnicas disponibles, fue posible regenerar
plantas de Duraznero libres de
virus como Sharka
o Plum Pox y algunas cepas del Necrotic Ringspot Virus (NRSV), cuando se microinjertaron in vitro
ápices del cultivar GF 305 (Mosella, 1979).
Procedimientos
Micro injerto in vitro
PROTOCOLO CLASICO. Descñbe,
como metodología de rutina, los pasos diagramados (Murashige et al., 1972; Navarro et al.,
1977; Alskief, 1978).
1. Preparación del poHalnjerto. Se describe la
obtención de plántulas de dos especies que se usarán como portmnjertos.
Dureznero. Las semillas
desprovistas del endocarpo se esterilizan con alcohol de 950 durante 2 min y luego se tratan con hipoclorito.de calcio
(99o-12@ ) >ás 0. 190 de Tween-20 durante 30 a 60 min. Luego se enjua- gan tres o más veces con agua
destilada estéril.
Las semillas se siembf n axI
R£Qtic Cliente III 40 ml de medio nutritivo gelificado (Knop-Heller)' contenidos en tubos de vidrio de 170 x 30 mm
que se.tapan con algodón hidrófobo y papel de
aluminio. El medio de cultivos.contiene agar (8-9 g/ litro), sacarosa
(40-60 gJ litro), y su pH se regYa entre
5.5 y 5.6.
En todos estos ensayos los
medios fueron esterilizados en autoclave a 105 0Cdos veces: la primera durante 15 min, y 24 horas después durante 5
min. La estratificación durante un lapso de 60 a 90 dlas a 4 0C en la oscuñdad Favorece
la ruptura de la dormencia de Wunus persica
cv. GF 305.
Luego de este plazo, y en un
tiempo de 4 a 9 dlas a 27 0Cen la oscuridad, se obtienen las plántulas que servirán de portainjerto.
Cftricos. Semillas del
‘citrange’ Troyer, cuyas cubiertas seminales han sido removidas, se esterilizan superficialmente con
NaOCl(0.5i‹›Ia1 que se añaden algunas gotas de Tween-20 como agente humectante. Luego se enjuagan tres o
más veces con agua destilada estéril. Se siembran las scijiillas así tratadas en 40 ml de medio
nutritivo (Murashige et al., 1962) gelificado (l Qi), con 20 gJ litro de sacarosa, a un pH de 5.6, en
tubos de vidrio de 170 x 30 mm y se colocan a 24 0C en la oscuridad; se logra así la germinación y
cl crecimiento de las plántulas unos l5 días después. En un lapso de 3 a 4 semanas, el epicótilo
mide más o menos 6 cm de longitud y las plantas están ya listas para el micro injerto.
2. Obtención del ápice
meristemático. El ápice meristemático mide de 0.2 a 0.4 mm en cítricos [(Citriis sinensis (L.) Osbeck cv. Thomson y Curtis fimon (L.) Burm.
f. cvs. Génova, Eureka y Lisboa)] y de
0.6 a l mm en el duraznero (Z'. persica cv. GF 305); comprende el
meristema propiamente dicho y uno o dos
primordios foliares. El meristema se obtiene de los brotes terminales de plantas mantenidas en el invernadero o de
plantas cultivadas de 2 a 3 afios en el campo, si se trata de cítricos. Los brotes se esterilizan
superficialmente con etanol 809s v/ v) durante 2 a 3 min y luego durante 10 a l5 min con
hipoclorito de calcio (69-99‹›) que contenga 0. l lo de Tween-20.
Luego los brotes sc lavan
con agua destilada estéril tres o más veces. ‘La operación se realiza con la ayuda dé un binocular de 20 aumentos en
una cámara de flujo laminar.
3. Microinjerto. Los
portainjertos desarrollados en condiciones estériles se extraen del tubo
de Germinación en la cámara de flujo; se
les secciona el epicótilo a 2 cm del cuello, y se eliminan los cotiledoiies lo mismo que las yemas
laterales si se trata de cítricos. La operación se realiza Sobre una caja Petri estéril.
El ápice ‘injerto’ se coloca
sobre la superficie decapitada y en contacto con la zona vascular, en el
duraznero. En los cítricos, en cambio, se hace una escisión en la corteza del epiciclo en forma de t invertida.
La plántula injertada se
coloca en un redondel de papel filtro perforado en su centro que le Servirá de soporte en el tubo de vidrio, de
manera que el sistema radical quede en contacto con un medio nutritivo líquido. Para los 517.
4. Incubación. Los
microinjcrtos se incuban en una cámara de ambiente controlado a 24::1:2 0C,
con una intensidad lumínica que varla de
600 lux (durazneros) a 1400-1600 lux (ci¡ricos), y con 16 horas de luz por día. El período de
incubación es de 20 a 60 días en durazneros y de 30 a 40 dlas en cítricos, momento en que las plantas se
trasplantan a macetas.
5. Trasplante a mecetes.
Logrado el desarrollo del injerto, las plántulas se extraen de los tubos y sus raíces sc‘lavan profusamente con agua a
fin de eliminar los restos del medio de cultivo. Luego se llevan a maletas que contienen un sustrato
arena/ turba (509'¢-509’‹›) para los cítricos, y turba, tierra dc hoja y arena (en ciertas
proporciones) para los durazneros. Estas mezclas se Esterilizan previamente en autoclave a 130
0C durante 30 min, o directamente mediante la aplicación de vapor durante una
hora. Las plántulas se cubren en las macetas con una bolsa de polietileno o con
un frasco de vidrio para reducir los efectos de la deshidratación. Las plantas
se colocan más tarde en zonas sombreadas del
Invernadero, donde se adaptan a las condiciones normales del cultivo
porque se abren paulati- namente las bolsas y
aumenta gradualmente la intensidad lumínica. Poste- riormente se
realizan los ‘indizajes’ virológicos.
PROTOCOLO MODIFICADO. Con el
fin de mejorar ciertas condi- ciones de
trabajo y obtener mejores resultados en
los durazneros, se introdujeron varias modificaciones a la técnica clásica antes descrita
(Moselle ct al., l979a) que se detallan a continuación.
l. Preparación del
portainjerto. Se describen los portainjertos del duraz- ncro y de los cítricos.
Duraznero. Aunque los portainjertos se desarrollarán en macetas y en condiciones
de invernadero, la estratificación se
hace con las máximas medidas de asepsia para asegurar la calidad
fitosanitaria de las plantas. Las
semillas desprovistas del endospermo se esterilizan, como en los casos anteriores, con alcohol de 95º durante 2 min
y luego con hipoclo- rito de calcio (9Q - l2P) durante 30 a 60 min agregando
Tween-20 (0. l Qi). Luego se enjuagan una vez con HC10.01 N y tres veces
más con agua estéril. Enseguida se
siembran asépticamente en tubos, como se describió anteriormente, o en cajas Petri entre dos capas de papel
filtro humedecidas con agua estéril. Permanecerán así a 4 0C en la oscuridad durante un período de 60 a
90 dlas para romper la latencia. Se lavan entonces con agua estéril y se siembran en macetas de
2 litros que contengan una mezcla, en proporciones iguales, de turba, tierra de hoja y arena, esterilizada
durante una hora con vapor; luego se colocan las macetas en el invernadero donde permanecerán entre 80 y 120 días hasta
alcanzar la altura de injerto (de 30 a 40 cm). Cítricos. Semillas de Cítrus
jambhiri Lusch (limón rugoso) servirán como portainjerto a Citrus limon (L.) Burm. f. cvs. Lisboa, Eureka y Génova. Las
semillas se esterilizan como se explicó en el
protocolo clásico para la microinjertación in vitro y se siembran en
bandejas de terminación (almácigos). Se
trasplantan luego las plántulas a recipien- tes de polietileno negro dc l5 x 40
cm con una mezcla estéril de arena y suelo (50Q -509 vJ v) donde permanecerán
en condiciones de inverna- dero durante
4 a 6 meses; finalmente, estas planticas serán microin- jertadas.
2. Preparación del ápice
‘injerto’. Los ápices meristemáticos que servirán de injerto en esta técnica in vivo, se extraen de los brotes
terminales de las plantas madre, se esterilizan según el protocolo clásico, y luego se someten.
Los ápices sembrados se
someten a incubación en una cámara
de ambiente controlado, con Temperaturas
de 24:£2 °C, y con una intensidad lumínica de 1000 a 1600 lux, 16 horas por día.
Después de l5 a 30 días, los
ápices pretratados alcanzan un tamaño cercano a l cm que permitirá Manipularlos fácilmente como ‘injertos’. Los
ápices se extraen entonces del tubo de cultivo, se Lavan con agua destilada y luego con una solución de 1.5 g/ litro dc
Dieca; se hace un corte en doble bisel en la base del ápice desarrollado in
vitro, Que debe coincidir con el corte
que se hará en el tallo decapitado del portainjerto. En las heridas de los cortes se aplica nueva- mente Dieca
como antioxidante con una jeringa provista de un filtro Millipore
(0.45 mm).
La elongación radical y el
crecimiento de la planta regenerada requeri- rán dc un tercer repique a un medio simple (M11 16 diluido a la mitad),
sin hormonas, con bajo tenor de azúcar (10 g/ litro), y con fuerte iluminación (4000 a 6000 lux, 16
h por día).
El trasplante de los ápices
enraizados a macetas se realiza en las mismas Condiciones descritas en' el
protocolo clásico para micro injertos in vitro.
Cuando se hacen todas las
manipulaciones dentro del tubo que contiene el porta injerto, disminuyen notablemente el estrés de la plántula, las
posibilidades de contaminación, y los riesgos de oxidación. La técnica aporta una mejora
importante al desarrollo radical de la plántula, que aumenta a 329 o el éxito del trasplante a
macetas; proporciona también una gran rapidez en la manipulación del Microinjerto porque logra
hasta cinco y seis micro injertos cada 10 minutos, y Disminuye considerablemente los volúmenes del
medio nutritivo empleado. Finalmente, los porcentajes de plantas libres de virus obtenidos por esta
técnica modificada permanecen invariables, y las plantas no presentan alteraciones
fisiológicas ni morfoló- gicas, luego del trasplante y de su desarrollo, que las alejen de sus tipos
parentales.
Conclusiones
Estos protocolos son
aplicables también a especies de cítricos como el limonero y el naranjo, y
se consideran una importante herramienta
para resolver problemas de limpieza de virus en otras especies leñosas frutales o forestales; se pueden
aplicar además a ápices de origen diverso como los de plantas infectadas por patógenos sistémicos,
los de callos organogénicos, los dc embriones
somáticos, los de embriones inmaduros, y otros.
Refuerzos como la termoterapia la
quimioterapia, o ambas, podrían utilizarse incluso durante los períodos de cultivo in vitro o de pretrata-
miento de los ápices; éstos podrán cultivarse luego directamente o microin- jertarse in vitro o
in vivo, aumentando ast las posibilidades de
eliminación de patógenos sistémicos.
