ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO: Área de preparación. Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también uno espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químico. ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO:
Área de preparación.
Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, pero debe proveer también uno espacio para almacenar los materiales de vidrio y de plástico, y los reactivos químico. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, los platos caliente con agitación, y otros elementos; también debe incluir vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración, y para la incubadora o la cámara de crecimiento.
Área de lavado y esterilización.
El área de lavado debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y agua fría y una fuente de agua de alto grado de pureza, preferiblemente agua doblemente destilada, y también debe proveer basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se deseche.
El área de esterilización debe tener espacio para el autoclave vertical y horizontal, el cual puede ser pequeño (olla de presión) o grande (de carga frontal y de enfriamiento lento y rápido), según sea el volumen del material que se procese. Esta área puede incluir espacio para estufas, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.
Área de trasferencia
En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de escisión, inoculación y trasferencia de los espantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo demanda los mas alto nivel de limpieza ambiental, se recomida la estalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión, o la construcción de cuartos de trasferencia. Sin embargos ciertas operaciones de inoculación como la excision y el cultivo de ápices y meristemas en tubo de ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y polvo.
Los gabinetes de flujo laminar deben ubicarse, en lo posible, en un lugar alejado de las puertas y con un mínimo de corriente de aire, con el fin de prolongar la vida útil de los filtros.
Materiales de laboratorio por equipo
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Materiales del equipo
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Parrilla
de calentamiento y agitación
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Marcador
indeleble
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autoclave
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Colores
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3 cajas
Petri con agar nutritivo (AN)
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3 cajas de Petri con agar papa
dextrosa (PDA)
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Agar nutritivo
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Agar papa dextrosa
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6 cajas de petri
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Procedimiento de esterilización
El calor es uno de los agentes que se utiliza con más frecuencia en la esterilización. Se puede usar en forma de llama directa, de calor húmedo (vapor) o de calor seco (aire caliente); cuando se utiliza el calor húmedo, puede ser en forma de calor abierto o de vapor bajo presión. Ocasionalmente se puede usar agua caliente pero no hirviendo.
Calor seco:
Los recipiente de vidrio secos que se utilizan para operaciones estériles, se pueden esterilizar por medio de aire caliente; para el efecto se colocan en una estufa de aire caliente a una temperatura mínima de 170 oC, preferiblemente durante dos horas, pero nunca menos de un hora. El algodón (debidamente envasado) a menudo se esteriliza por intervalos más largos, ya que tiende a contener esporas altamente resistentes; puesto que tanto el algodón como el papel toman un color marrón a temperatura de 190 oC o superiores, para estos materiales se debe usar una temperatura menor de 170 oC, manteniéndolo bajo ella por lo menos durante una hora.
Vapor bajo presión (autoclave) :
El vapor bajo presión es muy eficiente para destruir todas las formas de bacterias y hongos y sus esporas, y es el método más utilizado para esterilizar diferentes materiales incluyendo los medios de cultivo (siempre y cuando no contengan componentes termolabiles).
El autoclave mas utilizado actualmente en el laboratorio es la contraparte de mayor tamaño de la olla de presión común. Al utilizarlo, es necesario extraer todo aire antes de empezar el proceso de esterilización ya que, a presión iguales, la temperatura de una mezcla de aire y vapor no es tan alta como la del vapor puro; la extracción del aire se logra automáticamente al permitir que el vapor expulse el aire del aparato, antes de cerrar la válvula correspondiente.
La temperatura dentro del autoclave se regula mediante la presión y es directamente proporcional a esta; la presión se lee en un manómetro que forma parte del autoclave.
Para esterilizar los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se acostumbra usar una presión de 15 lb durante 20 minutos; a esta presión la temperatura del vapor es aproximadamente 121oC, suficiente para matar virtualmente todas las formas de vida in 5 minutos. Sin embargo se debe recalcar que el tiempo de exposición requerido dependerá tanto del tipo de material que se va a esterilizar como de sus cantidades. Si se desea que la esterilización sea completa, el calor debe penetrar en cada porción del material; ninguna sustancia es estéril si queda en ella un organismo viable o espora.
La siguiente es una guía para presiones variables:
10 lb de presión (115.5oC) durante 30 minutos
15 lb de presión (121.5oC) durante 20 minutos
20 lb de presión (126.5oC) durante 15 minutes
Para las operaciones mayores se recomienda colocar detectores de esterilización en diferente puntos dentro del autoclave o dentro de la masa de material que si trata, para asegurarse de que todas las partes han alcanzado la temperatura deseada.
Calor humado a 100oC:
Con este método probablemente sea suficiente una sola exposición de 15 minutos al calor vivo (100oC) para matar todas las formas vegetativas microbianas. Sin embargo, así no se matan necesariamente todas las formas de espora y puede ser práctico, por consiguiente, efectuar la esterilización intermitente, siempre y cuando se disponga de cierto equipo.
En este caso, la exposición puede ser de 30 a 60 minutos y se repite diariamente durante tres días consecutivos, conservando el material a la temperatura del cuarto o en una incubadora entre una exposición y otra.
Teóricamente la primera exposición destruye todas las formas microbianas; durante las próximas 24 horas, generalmente germinan las esporas convirtiéndose en formas vegetativas que mueren en la segunda exposición; la tercera exposición es simplemente un medio de prevención para destruir las esporas vivas que hayan podido teñir una germinación lenta.
A veces el procedimientos se modifica utilizando temperaturas inferiores a el agua hirviendo y aumentando el numero de las exposiciones hasta cuando haya una seguridad razonable de esterilidad. Se utilizan temperaturas de 60 a 80oC se repiten sucesivamente las exposiciones durante 4 a 7 días.
Este método del calor húmedo a 100oC, conocido como ¿método de Koch¿ se utilizan en la esterilización de medios que contienes componentes capaces de soportar las exposición a temperaturas de vapore vivo, pero no a las temperaturas mayor que tiene el vapor bajo presión. No obstante, este método no esta exento de problemas; las esporas pueden no desarrollarse en las soluciones no nutritivas como el agua corriente, por lo cual se recomienda reemplazarlo, cuando sea posible, por el método de filtración; sin embargo si menciona, incluso en este caso, como una alternativa cuando no se dispone de las instalaciones o medios para esterilizar por filtración.
Filtración:
La esterilización de medios va acompañada rutinariamente de la filtración a través de filtros especiales a prueba de hongos y bacterias. Es claro que los filtros y otros aparados se deben esterilizar antes de tratar de utilizarlo para remover los contaminantes de un líquido.
Obviamente el tamaño del poro es el principal factor en la capacidad de retención de bacterias de estos filtros; otros factores que afectan la penetrabilidad del filtro por los microorganismos son el pH, la carga eléctrica del material filtrado, la temperatura, la presión y la duración del procedimiento de filtración, así como el efecto de la absorción de proteínas y otras sustancia en el filtro; también puede haber contaminación en el filtrado a causa de una presión excesiva en filtro o de fugas de las líneas al vació cuando se utiliza presión negativa.
