El objetivo de esta etapa es mantener y aumentar la cantidad de brotes para los nuevos ciclos de multiplicación sucesivos y poder destinar parte de ellos a la siguiente etapa de producción (enraizamiento, bulbificación, etc.). Es importante señalar que en esta etapa, cualquiera que sea la vía de regeneración empleada, es conveniente evitar la formación de callo para disminuir el riesgo de variación somaclonal. En esta etapa, los medios de cultivo, los reguladores de crecimiento como auxinas, citocininas y ácido giberélico y las condiciones de crecimiento juegan un papel crítico sobre la multiplicación clonal de los explantos.
Ambas vías de regeneración, organogénesis y embriogénesis, pueden darse en forma directa o indirecta. Esta última implica la formación de callo. En general, la organogénesis conduce a la producción de vástagos unipolares que enraízan en etapas sucesivas, mientras que por embriogénesis somática se forman embriones bipolares a través de etapas ontogénicas similares a la embriogénesis cigótica.
La organogénesis puede darse por inducción de yemas axilares o adventicias. La inducción de yemas axilares comprende la multiplicación de yemas preformadas, usualmente sin formación de callo.
La inducción de yemas adventicias comprende la inducción de tejido meristemático localizado mediante un tratamiento con reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciación del primordio y desarrollo del vástago, esto último generalmente en ausencia del regulador de crecimiento que indujo la organogénesis.
La principal desventaja del primer método es que el número de yemas
axilares por explanto limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que la inducción de vástagos ocurre en sitios distintos al de los meristemas.
axilares por explanto limita la cantidad de vástagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por un aumento en la tasa de multiplicación con los sucesivos subcultivos. La formación de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la producción de vástagos, ya que la inducción de vástagos ocurre en sitios distintos al de los meristemas.
La embriogénesis somática es una vía más conveniente porque permite saltar las etapas de formación de yemas y enraizamiento regenerando plantas en una forma mucho más rápida y eficiente, disminuyendo además el riesgo de variación somaclonal. A su vez, la disponibilidad de protocolos para la obtención de embriones somáticos es clave para la automatización de la micropropagación y la consecuente reducción de costos para su implementación a escala comercial. Los biorreactores son equipos que contienen aproximadamente 2 litros de medio de cultivo líquido estéril y donde los embriones somáticos pueden regenerar y madurar a partir de suspensiones celulares, sustentados por la circulación permanente de nutrientes y de aire.
Hoy en día, el empleo de biorreactores para la micropropagación a gran escala está limitado por dos motivos críticos. En primer lugar, el declinamiento de las líneas celulares (clones) por efecto de la variación somaclonal y segundo, por los altos costos asociados con la conversión de estos embriones somáticos en plántulas.
Las condiciones culturales en las cuales crece el explanto son el resultado de la interacción de tres factores: el estado del explanto o material vegetal, determinado en parte por el medio de cultivo, el recipiente de cultivo y el ambiente externo o condiciones de crecimiento del cuarto de cultivo. La capacidad de respuesta de los explantos a un mismo medio de cultivo cambia con el número de subcultivos, el tipo de explanto subcultivado y el método del repique. Por, esto mismo, el medio de cultivo debe optimizarse a fin de lograr la mayor tasa de multiplicación vegetativa. Comúnmente se emplea como medio basal el medio MS completo sugerido por Murashige & Skoog (1962) suplementado con 3% de sacarosa como fuente de carbono. A este medio se le adicionan además reguladores de crecimiento, tanto del tipo de auxinas como de citocininas.
La etapa de multiplicación generalmente comprende dos períodos, la fase de inducción y la fase de multiplicación propiamente dicha. La primera implica, generalmente, el empleo de concentraciones elevadas de reguladores de crecimiento (generalmente de auxinas más que citocininas) para favorecer la desdiferenciación. La segunda etapa requiere del empleo de un balance hormonal adecuado para favorecer los procesos de diferenciación y multiplicación celular. En este caso, el sistema es más dependiente de reguladores del tipo de las citocininas. En algunos casos, como ocurre en la formación de embriones somáticos, se requiere de una tercera y cuarta etapa, denominadas de maduración y de germinación respectivamente, cuya duración varía entre 1 a 2 semanas.
Para la etapa de maduración se adiciona ABA (ácido abscícico) al medio basal en rangos de 5 a 20 micromolar, seguido del subcultivo a un medio basal conteniendo AG (ácido giberélico) en concentraciones de 0,1-1 micromolar, cuyo fin es lograr la germinación de los embriones obtenidos.
Los tipos de auxinas (a) y citocininas (b) y los rangos de concentración más empleados se mencionan a continuación: a) IBA (ácido 3-indolbutírico): 0,1-2 mM; 2,4-D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético): 4-35 mM; AIA (ácido 3-
indolacético): 0,1-2 mM; ANA (ácido naftalenacético): 1-5 mM; y, picloram: 1-10
mM; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 mM; CIN (cinetina): 0,1-1 mM; ZEA (zeatina): 1-10 mM; 2ip (isopentiladenina): 1-5 mM; y, TDZ (tidizuron): 0,01-1 mM.
indolacético): 0,1-2 mM; ANA (ácido naftalenacético): 1-5 mM; y, picloram: 1-10
mM; b) BA (N6-benciladenina): 1-20 mM; CIN (cinetina): 0,1-1 mM; ZEA (zeatina): 1-10 mM; 2ip (isopentiladenina): 1-5 mM; y, TDZ (tidizuron): 0,01-1 mM.
Los tipos de reguladores, sus combinaciones y rangos de concentraciones deben ser optimizados para cada especie, genotipo y etapa de multiplicación determinada. Los cultivos se incuban en luz a 27±2º C con 14 horas de fotoperíodo e intensidad lumínica moderada (100 mmol m-2 s-1). La presencia de compuestos fenólicos oxidados se encuentra asociada con tejidos vegetales sometidos a situaciones de estrés, tales como aquel provocado por el daño mecánico producido durante el aislamiento del explanto de la planta madre.
Estos compuestos se encuentran en general en las plantas en estado reducido y el ataque de patógenos produciría su oxidación y liberación. Esto inhibiría el crecimiento de los mismos, dañando, indirectamente, a los explantos. Estas sustancias (quinonas, fitoalexinas y protectores de auxinas) son muy lábiles y fácilmente oxidables. Por esto mismo, durante el establecimiento y multiplicación in vitro es necesario emplear estrategias tendientes a disminuir el estrés de las plantas y limitar al mínimo la producción y oxidación de los compuestos fenólicos.
Para ello se emplean agentes absorbentes de fenoles en el medio de cultivo, tales como el carbón activado y la polivinilpirrolidona o antioxidantes como el ácido ascórbico, la modificación del potencial redox con agentes reductores, la inactivación de las fenoloxidasas con agentes quelantes o la reducción de su actividad o afinidad por el sustrato utilizando un bajo pH, o bien cultivando in vitro en condiciones de oscuridad.
Es recomendable además lograr que la tasa de intercambio gaseoso entre los ambientes del recipiente y externo sea óptima, evitándose la acumulación de CO2 y de etileno. En este sentido, el sellado del recipiente es importante, el intercambio gaseoso es más limitado con el empleo de una tapa de plástico que con un film de polietileno extensible.La utilización de una tapa perforada con tapón de gomaespuma es altamente recomendable.
Los principales problemas que pueden presentarse durante los sucesivos subcultivos in vitro son la vitrificación y la producción de compuestos fenólicos por los explantos.La vitrificación consiste en un proceso de morfogénesis anormal con cambios anatómicos, morfológicos y fisiológicos que producen hojas de una apariencia vidriosa. Este fenómeno está regulado por dos factores clave que son la humedad relativa y el potencial agua, y afecta a dos procesos fisiológicos fundamentales: la fotosíntesis y la transpiración.
Debido a la disfunción metabólica asociada, las plantas se vuelven heterótrofas y transpiran excesivamente debido a un mal funcionamiento estomático y a cambios estructurales en las paredes celulares. La principal consecuencia de la vitrificación es la baja supervivencia de las plántulas obtenida durante la aclimatación ex vitro. Por ello, es fundamental conocer el rol de los distintos factores que inciden negativamente sobre el desarrollo morfogénico normal (autótrofo) in vitro. Estos factores son el ambiente de cultivo, los componentes orgánicos e inorgánicos del medio, los reguladores de crecimiento, la luz y la temperatura. Una baja humedad relativa, elevada irradiación, la remoción de la fuente de carbohidratos del medio de cultivo y la defoliación de las plantas para estimular la formación de hojas nuevas estimulan la fotosíntesis y otras actividades metabólicas de las hojas en forma normal.
Otras estrategias para lograr un óptimo crecimiento implican el empleo de retardantes del crecimiento para estimular la formación de hojas nuevas después del transplante. O bien, el empleo de altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) para estabilizar la vía de lignificación y prevenir la vitrificación a través de la inhibición de la hiperhidratación, la hipolignificación y la formación de aerénquima.
BIBLIOGRAFIA:
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