En las especies del género Musa, es posible obtener explantos a partir de cualquier parte de la planta que contenga un meristemo apical: el pseudotallo progenitor y sus colinos, mirones, puyones, brotes laterales u ojos diminutos.
- Es preferible aislar los explantos de colinos jóvenes y vigorosos, de apariencia sana, de 40 a 100 cm de altura y con un cormo de 10 cm de diámetro.
- Éstos se recolectan de una planta madre en floración a fin de garantizar que se ajustan al tipo varietal.
Generalmente solo se puede utilizar el meristemo apical de un colino que ha sido recortado. Con el tiempo, también se podrán utilizar las yemas más pequeñas (ojos en latencia) del cormo como explantos para iniciar el cultivo de tejidos.
Aislamiento y desinfección de explantos
- Corte, del colino, un cubo de tejido (de 2x2x2 cm) que contenga el meristemo apical.
- Si hay yemas en la superficie del cormo, extírpelas junto con 0.5 cm del tejido que las rodea.
Esterilización de la superficie de los explantos
- Transfiera cada cubo de tejido a un matraz de Erlenmeyer distinto.
- Sumerja cada cubo de tejido en etanol al 95% y agite suavemente.
- De inmediato, decante el etanol y enjuague el tejido durante 30 segundos en agua deionizada estéril.
- Transfiera el matraz a una cámara con flujo de aire laminar.
- Sumerja cada cubo durante 20 minutos en una solución de hipoclorito al 2% o en una solución de cloro comercial diluido, a la que se agregó unas cuantas gotas de Tween 20 (surfactante). Si no tiene Tween, puede utilizar detergente líquido para lavar platos.
- Cubra los matraces con una tapa de caja de Petri y mueva la solución con frecuencia utilizando un movimiento circular.
- Decante la solución de hipoclorito.
- A continuación, enjuague tres veces en un período de 10 minutos con agua deionizada estéril y decante.
Escisión de explantos
Los ápices caulinares del banano están envueltos en muchos inicios foliares enrollados apretadamente. El ápice caulinar mide entre 2 y 5 mm y consiste en el meristemo cubierto por varios primordios foliares, y apoyado en una pequeña base de tejido del cormo.
- Quite, de todos los lados del cubo, el tejido externo que fue expuesto a la solución desinfectante.
- Flamee los instrumentos de disección repetidamente durante la manipulación.
- Quite el recubrimiento de primordios foliares capa por capa y corte la mayor cantidad de tejido del cormo como sea posible; esto evita que el cultivo se ennegrezca durante la iniciación.
Cuando existe un grave riesgo de contaminación bacteriana (por ejemplo, cuando los colinos son cosechados durante la temporada de lluvias), se recomienda extirpar un explanto más pequeño que consiste en el meristemo cubierto por uno o dos primordios foliares (1 mm).
- Para extirpar el ápice del meristemo, coloque el ápice caulinar que extirpó bajo un microscopio de disección (dentro de una cámara con flujo laminar) y reduzca aun más su tamaño quitando los primordios foliares y parte del tejido del cormo en la base del explanto.
Iniciación de un cultivo de tejido
- De inmediato, coloque el explanto extirpado sobre un medio de iniciación de cultivo.
- Empuje un poco el explanto dentro del medio de cultivo para asegurar que haya buen contacto entre los dos.
- Mantenga los cultivos en oscuridad total durante una semana a fin de reducir el ennegrecimiento causado por la oxidación de polifenoles.
- El tejido empezará a crecer como dos semanas después de la inoculación. Al mismo tiempo, se hincha el tejido de la lámina foliar y del cormo, su color cambia de blanco a verde y hay abundante oxidación de los compuestos polifenólicos emitidos por el tejido del cormo (ennegrecimiento del tejido y del medio de crecimiento que lo rodea).
- Transfiera los explantos a medio fresco cada dos semanas durante las primeras ocho semanas de cultivo.
- De ser necesario, recorte el tejido del cormo ennegrecido y/o hinchado, de manera que quede intacto el tejido viable de los primordios foliares del explanto.
- Después de 10 ó12 semanas, el explanto se convertirá en colino.
- Registre la tasa de supervivencia y la contaminación visible cada vez que transfiera una repetición.
El tamaño del explanto es un factor importante en el cultivo de los ápices caulinares del banano. Si se utilizan explantos muy pequeños, esto incrementa la probabilidad de producir cultivos sin bacterias y sin virus, pero la tasa de mortalidad es muy elevada. Los explantos de tamaño intermedio producen cultivos limpios y vigorosos que se multiplican rápidamente. Los explantos de gran tamaño tienden a presentar más ennegrecimiento y más contaminación, con lo cual se producen menos cultivos limpios y vigorosos.
Iniciación de cultivos de tejido a partir de semillas
Cuando se trata de especies silvestres de banano, se puede utilizar la semilla para iniciar los cultivos de tejido, si no se cuenta con material de propagación vegetativa. Como la germinación de la semilla de banano es escasa e irregular, lo mejor es hacer un cultivo directo de un embrión axénico aislado de la semilla.
Desinfección de la supreficie de la semilla de banano
- Remoje las semillas durante 2 ó 3 días en agua del grifo, sin moverlas, en un matraz de Erlenmeyer. Cambie el agua todos los días para evitar contaminación o crecimiento de hongos.
- Remoje la semilla durante dos minutos en EtOH (95% v/v) en un matraz de Erlenmeyer y cubra el matraz con una tapa.
- Decante y transfiera los matraces a una cámara con flujo de aire laminar. Desinfecte la semilla en una solución de hipoclorito al 1.5% y 1 ó 2 gotas de Tween durante 20 minutos y agítela suavemente. Lave la semilla esterilizada con agua desionizada estéril dos veces en 15 minutos.
Aislamiento de embriones
- Utilice unas pinzas para fijar la semilla en una almohadilla de cortar estéril.
- Corte la semilla longitudinalmente junto al micropilo.
- Quite el pedazo y recoja el embrión.
- Coloque los embriones en medio de germinación de embriones dentro de tubos de ensayo de vidrio.
- Incube los embriones en condiciones normales para los cultivos de ápices caulinares de banano.
La germinación comienza como dos días después de la inoculación; el color cambia de blanco a verde y se forman abundantes pelos radiculares. Una vez que los cultivos se han iniciado, hay que empezar a someter el material a prueba regularmente para verificar su asepsia.
Pruebas de contaminación (por bacterias)
Un requerimiento indispensable al establecer y mantener de manera permanente una colección in vitro, es la asepsia de los cultivos de tejido. Asimismo, es fundamental que los cultivos que se envían a otros países o que se utilizan para los distintos propósitos de la investigación estén estériles.
Para proteger los cultivos in vitro contra la contaminación microbiana, y para no diseminar contaminantes en el sistema de cultivo de tejidos, es necesario vigilar que el material permanezca aséptico en ciertas etapas cruciales (vea, más adelante, la sección de las pruebas de cultivo de tejido) y monitorearlo regularmente durante su procesamiento en el banco.
Examen visual
- La contaminación bacteriana se presenta en el medio como “nubes” ténues alrededor de la base de los explantos o del cultivo. Para detectar la contaminación con facilidad, utilice un gelificante transparente (Gelrite) en el cultivo de tejido.
- A veces es posible detectar una colonia de bacterias creciendo alrededor del tejido en la superficie del medio de crecimiento.
No obstante, los contaminantes por lo general permanecen en la parte más profunda del tejido vegetal y sólo aparecen en el medio de crecimiento cuando las condiciones les son favorables (cuando hay una mayor concentración de sacarosa, un cambio en el pH del medio, un aumento de la temperatura ambiente, deterioro del tejido vegetal, etc.).
Prueba del cultivo de tejido
Los cultivos de tejidos deben someterse a prueba cuando son introducidos como material nuevo, durante el almacenamiento y cuando se hace el subcultivo anual. Para la prueba de selección, que es sencilla y no destructiva, se hace un estriado de dilución con la base del ápice caulinar sobre un medio bacteriológico semi-sólido.
- La prueba debe hacerse al momento de realizar el subcultivo, justo antes de transferir el explanto al medio de crecimiento.
- Se aísla un solo ápice caulinar del cultivo y se le recorta a un tamaño que sea adecuado para transferirlo a un medio de cultivo fresco.
- La base del cormo del ápice caulinar se estría tres veces sobre el medio bacteriológico y de inmediato se coloca en un medio que promueve el crecimiento de plantas.
- Las cajas de Petri se sellan con parafilm y se incuban a una temperatura de 28°C.
- El medio de prueba estándar es un medio bacteriológico de amplio espectro que fomenta el crecimiento de una amplia gama de bacterias. Este medio contiene agar nutritivo (8%) enriquecido con extracto de levadura (5 g/l) y glucosa (10 g/l).
- La mayoría de las bacterias son de crecimiento rápido y aparecen en el medio después de dos o tres días, pero los contaminantes de crecimiento lento se tardan hasta ocho semanas en aparecer en el medio. Por eso es importante observar el medio durante por lo menos dos meses después de la prueba.
- En caso de obtener resultados no concluyentes, se pueden aplicar otros métodos de detección:
- Utilice un medio de crecimiento específico y selectivo.
- Macere el tejido e incube el medio de crecimiento bacteriano en líquido.
- Utilice los métodos de reacción de polimerización en cadena (PCR, siglas en inglés).
Tratamiento descontaminante
Los cultivos contaminados se eliminan sometiéndolos al autoclave. Sin embargo, cuando los resultados correspondientes a todas las repeticiones de una accesión al momento de la iniciación o en el almacenamiento son positivos, el material contaminado no se puede desechar sin más, porque la accesión podría ser única o difícil de reponer. En ese caso, el material es sometido a un tratamiento descontaminante.
- Antes de aplicar el tratamiento descontaminante, se recomienda caracterizar las bacterias aisladas para determinar cuál sería el método de erradicación más eficaz.
- En las operaciones de rutina, es preferible utilizar un cultivo del meristemo, que solo requiere una caracterización aproximada del contaminante, a aplicar un tratamiento con antibióticos cuya eficacia terapeútica depende de la identificación específica del contaminante, la sensibilidad bacteriana y la fitotoxicidad. Por otra parte, la aplicación de antibióticos conlleva el riesgo de que se desarrollen cepas bacterianas resistentes.
Eliminación de bacterias mediante el cultivo del meristemo
Esta técnica requiere aislar meristemos asépticos de los cultivos in vitro contaminados. Dependiendo del tipo de bacteria contaminante, el método de erradicación se refina aun más realizando cultivo de meristemos de plantas in in vitro contaminadas o de plantas contaminadas cultivadas en el invernadero.
- Se ha encontrado que lo más eficaz para eliminar bacterias como Bacillus sp., es cultivar meristemos de 1 mm de largo que fueron aislados directamente de plantas in vitro contaminadas.
- Aísle el ápice caulinar del cultivo contaminado y luego, bajo un microscopio de disección, redúzcalo para que mida 1 mm de largo. Quite las hojas jóvenes hasta que solo quede el domo recubierto por tres primordios foliares.
- Es importante tener mucho cuidado al quitar el tejido del cormo y quitar lo más posible, pues es allí donde las bacterias normalmente se encuentran.
- El ápice del meristemo se debe extirpar en condiciones rigurosamente asépticas a fin de reducir al máximo el riesgo de transferir bacterias a la zona meristemática interna del explanto.
- Es esencial que el explanto no entre en contacto más que con superficies e instrumentos estériles. Cuando no se están usando, las pinzas y los escalpelos se flamean o se esterilizan en un esterilizador de microesferas de vidrio; asimismo, la almohadilla de cortar debe esterilizarse antes de que entre en contacto con el ápice recién cortado.
Eliminación de bacterias de las plantas de invernadero
En algunos casos ––por ejemplo, cuando los cultivos de tejido están contaminados con bacterias de tamaño muy pequeño–– el método antes descrito no es muy eficaz. Para poder eliminar este tipo de bacterias, el tamaño del explanto se debe reducir aun más. Sin embargo, cabe señalar que los explantos tan pequeños con frecuencia no llegan a establecerse in vitro. Por lo tanto, otro método para eliminar estas bacterias es aislar explantos de plantas de invernadero y aclimatar las plantas in vitro.
- Transfiera las plantas in vitro que están contaminadas a tierra colocada en macetas PET en un invernadero; déjelas crecer durante un período de 3 a 6 meses o hasta que el diámetro de los tallos alcance por lo menos 5 cm.
- Mantenga las plantas secas durante 2 ó 3 semanas; después, aísle los explantos de ápices que miden de 1 a 3 mm para re-iniciar los cultivos in vitro .
- Los cultivos recién establecidos deben ser sometidos a prueba durante por lo menos cinco ciclos de subcultivo para confirmar que están libres de bacterias.
Tratamientos antibióticos
Un tratamiento antibiótico requiere que el ápice caulinar contaminado sea expuesto a una concentración bactericida del antibiótico que no afecte el crecimiento del ápice caulinar.
El antibiótico que más se usa es la rifampicina, que mata las bacterias Gram positivas y negativas sin afectar el crecimiento del ápice caulinar del banano (la concentración bactericida máxima [MBC, siglas en inglés] de la rifampicina no llega a ser fitotóxica). Los otros antibióticos que se han ensayado, o no matan la mayoría de los aislamientos bacterianos o tienen un efecto tóxico en el tejido vegetal.
- Prepare, en matraces de Erlenmeyer, medio de regeneración líquido con base MS que contenga rifampicina HCl (100 mg/l). Coloque un ápice contaminado de 0.5 mm de largo en 10 ml de medio en un matraz de Erlenmeyer e incúbelo durante 30 días a 28°C en un agitador rotativo (60 rpm) y bajo una intensidad de luz de por lo menos 25 mµ m² s-1.
- Después de un mes, saque el material tratado del cultivo. Extirpe el ápice caulinar aséptico y cultívelo en medio fresco, sin antibióticos.
- Los cultivos recién establecidos deben ser sometidos a prueba durante por lo menos cinco ciclos de subcultivo a fin de confirmar que están libres de bacterias.
BIBLIOGRAFIA:
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